作者：哈尔滨市第五医院口腔科（高振涛、李宗瑜、冉庆祥、唐臣）；杭州启迪生物科技有限公司技术部（张泽宇）；首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室（崔磊）
近年研究发现，脂肪基质中存在着一类具有多向分化潜能的成体间质干细胞——脂肪干细胞（adipose derived stem cell，ADSC），在体外向成骨、软骨、脂肪、肌肉等多个方向分化。脂肪干细胞体内分布广、分离培养操作简单，较骨髓间充质干细胞bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC）具有更强的扩增能力且无明显的对血清批号的依赖性，因此ADSC具有更为重要的临床应用价值。本研究经哈尔滨市第五医院医学伦理委员会审核并批准（批准号：哈尔滨市第五医院伦理委员会2012年1号），利用ADSC作为种子细胞诱导构建的组织工程骨修复上颌骨缺损并种植义齿，现报告如下。
1.临床资料：
患者女性，58岁，因交通事故致左上前牙缺失、牙槽突骨折合并骨缺损就诊。检查：颜面基本对称，张口度正常，12缺失，牙龈组织完整，但缺牙区唇侧牙槽突塌陷明显、凸凹不平（图1，2）。CT检查示：12缺失，唇侧牙槽骨缺失8.4 mm×1.0 mm×4.8 mm，并可见散在碎骨。诊断：上颌左侧牙槽突骨折伴缺损、12缺失。将治疗方案与患者及家属充分沟通，知情同意后治疗。
2.脂肪干细胞培养：
患者腹部切取1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的皮下脂肪组织，生理盐水冲洗后将脂肪抽吸获得物以等体积磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3遍，离心后吸出PBS，保留上层脂肪组织。加入0.075%的I型胶原酶，在37℃振荡条件下消化60 min。以含10%胎牛血清的基础培养基（Dulbecco’S modified eagle medium，DMEM）培养液终止消化。以1 200×g离心10 min，去上层液及脂肪，所获得细胞以生长培养液重悬，接种于直径100 mm的细胞培养皿中，放人恒温培养箱内37℃、5%CO2、100%湿度条件下常规培养，至70%～80%融合状态时以1：3的比例传代扩增细胞。传至第3代时，用β-磷酸甘油钠（10 nmol/L）、地塞米松（8~10 mol/L）、L-磷酸抗坏血酸（50μmol/L）、L-谷氨酰胺（300 mg/L）、二羟维生素D3（10 mmol/L）对细胞进行成骨诱导。
3.组织工程骨体外构建：
成骨诱导后的人ADSC以5×1010个/L的浓度接种于同种异体脱钙骨（partially demineralized bone matrix，pDMB）（杭州启迪生物科技有限公司）。支架大小为1 cm×2 cm×0.5 cm，支架孔隙率为75%±8%，平均孔径（310±54）mm。按患者术前三维CT镜像确定骨缺损的大小。体外培养3周，倒置显微镜观察细胞在脱钙骨中生长情况。细胞以荧光染料DIO荧光标记，将5μl DIO（Molecular Probes，美国）与1 ml DMEM混匀配制成染液，将细胞重悬于染液中，在37℃培养箱中静置20 min，1 500 r/min离心5 min，弃去染液。接种于脱钙骨，激光共聚焦显微镜观察细胞分布情况。
4.组织工程骨及种植体植入：
经过3周培养出组织工程骨。局部麻醉下按外科常规手术方法暴露骨缺损区，刮除骨碎块和肉芽组织，彻底止血，将工程骨用生理盐水冲洗并修整使其与骨缺损区吻合后，把工程骨龛入缺损区使其边缘和周围正常骨密切接触，见工程骨在缺损区稳固后严密缝合软组织封闭创面，术后应用抗生素7 d。术后定期复查CT。植骨术后5个月，在12缺牙区植入直径3.1 mm、长12 mm种植体（士卓曼，瑞士）1枚。
5.结果：
取自患者皮下脂肪组织的脂肪干细胞，体外生长情况良好，细胞呈长梭形（图3A）。成骨诱导后，茜素红染可见大量钙结节形成（图3B）。细胞经DIO荧光染料标记后，接种于脱钙骨；3周后可见荧光标记细胞均匀分布于孔壁（图3C）。术后1、2、4个月CT显示植骨区新生骨组织的改变区域逐渐扩大，密度逐渐增高。植骨术后5个月植骨区牙槽骨外观丰满（图4），植骨术后5个月植入种植体（图5），种植术后1年种植体与骨组织愈合良好，修复完成（图6）。组织学观察结果显示，形成的组织工程化骨具有正常的骨小梁结构，骨组织中间可见骨陷窝，骨小梁表面黏附活跃的成骨细胞（图7）。
6.讨论：
本病例采用的种子细胞是脂肪源性间充质干细胞，具有来源广泛，取材方便，干细胞量大和易于分离纯化的优点。支架材料的异体脱钙骨具有生物相容性和生物降解性，并保留了胶原支架的立体多孔状结构。同时脱钙骨能为成骨细胞的生长、分化提供良好的基质，并在修复骨缺损时有明显的骨诱导作用。本病例牙间隙过小，因此只对12牙修复，匡未行修复，且到牙倾斜角大，与患者反复沟通将到磨改，烤瓷冠修复，患者不同意治疗方案，虽然美观性差但功能良好。本病例随访的时间尚短，需要长期随访。
来源：中华口腔医学杂志
