作者：唐成芳1  阮建平2  朱勇1  李子夏1  左艳萍1  徐红艳3

作者单位：1.西安医学院口腔医学系，西安 710021；2.西安交通大学口腔医院预防科，西安 710004；3.陕西省人民医院口腔科，西安 710076

[摘要]  目的  评价马尾松松针提取物（PMNE）抑制根面牙本质脱矿的效果。方法  将根面牙本质块根据pH循环中所用实验溶液随机分为去离子蒸馏水（DDW）组，氟化钠（NaF）组，4%、8%和12%PMNE组，试件进行为期8d的pH循环。显微CT选区测定各组未脱矿牙本质和脱矿牙本质的牙本质矿物密度（DMD）及两者DMD差值（ΔDMD），扫描电镜下观察pH循环后牙本质表面形貌。结果  PMNE各组和NaF组ΔDMD均显著低于DDW组（P<0.05），且8%pmne组和12%pmne组δdmd组间差异无统计学意义（p>0.05），均显著低于4%PMNE组，高于NaF组（P<0.05）。扫描电镜见PMNE组牙本质小管不全暴露，小管开口程度明显小于DDW组，大于NaF组。结论  PMNE可抑制根面牙本质脱矿，减缓酸对DMD的降低，具有一定的抗龋活性。8%PMNE即可达到较好抑制脱矿的效果。

[关键词]  马尾松松针提取物； 根面龋； 牙本质； 脱矿； 矿物密度

根面龋是发生在牙颈部涉及牙骨质、牙本质的特殊龋坏。老年人因牙龈退缩以及牙颈部薄弱部位暴露，更易发生根面龋[1-2]。据第3次全国口腔健康流行病学调查报告，全国65~74岁老年人患龋率为98.4%，根龋患病率为63.6%，根面龋是老年人牙齿缺失的主要因素之一，严重危害着老年人的口腔健康[1,3]。因而，采用合理、安全有效的措施防治根面龋的发生和发展是非常必要的。研究[4-5]证实龋病的发生发展是牙体组织在细菌产酸作用下，发生的矿物质溶出和有机物的崩解。因而，控制菌斑，增强矿物牙体组织抵抗酸/耐脱矿能力，促进脱矿组织再矿化被认为是“应用微创理念”防治老年龋进展的重要措施[5-6]。

松针，又称松叶松毛，是松科松属植物的叶，性温味苦，自古记载其具有补益人体、祛风止痛、活血化淤、固齿驻颜等功效。研究证实松针提取物有抑菌/抗菌、抗衰老、抗肿瘤等多种生物学活性[7-9]，也被用于牙膏的研制[10]。本实验采用显微CT（micro computer tomography, Micro-CT）和场发射扫描电镜（field emission scanning electron microscopy，FESEM）分析了我国广泛分布的马尾松松针提取物（Pinus massoniana needle extract，PMNE）对根面牙本质抗酸/抑制脱矿能力的影响，探索PMNE抑制根面龋的潜能。

1  材料和方法

1.1  实验材料和器械

10︰1 PMNE（西安奥赛生物技术有限公司），氟化钠（NaF，分析纯）、磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）、乙酸（CH3COOH，分析纯）（西安化学试剂厂），羟乙基哌嗪乙磺酸（Sigma公司，美国），抗酸指甲油（Revlon公司，美国）。

采用去离子蒸馏水（distilled deionized water，DDW）为溶剂配制如下溶液。4%、8%和12%PMNE溶液：将PMNE加入DDW中配制质量体积百分浓度为12%的澄明溶液，DDW稀释方式配制4%和8%的PMNE溶液，备用；用DDW溶解适量NaF配制成0.1%的NaF溶液；中性缓冲液：20 mmol·L-1羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH为7.0[11]；酸性缓冲液：50 mmol·L-1 CH3COOH，1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH为5.0[11]。

慢速切割机（UNIPOL-830，沈阳科晶有限公司），恒温水浴箱（上海医疗器械厂），维氏显微硬度计（HXD-1000TM，上海泰明光学仪器有限公司），FE-SEM（FESEM S-4800，Hitachi公司，日本），Micro-CT（Explore Locus SP，通用医疗公司，美国），电感耦合等离子质谱仪（热电有限公司，美国）。

1.2  样本制备

取颈部平坦且完整无龋坏的新近拔除第三磨牙35颗，用慢速切割机在流水降温下去除冠方牙体组织，制备3 mm×4 mm×2 mm的根面牙体组织块。在流水降温下用2 000目碳化硅砂纸打磨牙体表面至牙本质层，并使牙本质表面光滑平整。按照文献[12]的方法，用显微硬度计挑选出牙本质表面硬度在35~50维氏硬度值之间的试件50个。在牙本质的光滑表面一端预留3 mm×2 mm大小的开窗区，其余部位均匀涂布抗酸指甲油，干透后涂布第二层。

1.3  实验分组及pH循环

按照所用实验溶液不同，将50个试件随机分为5组，分别为DDW、NaF、4%PMNE、8%PMNE和12%PMNE组，每组10个试件，其中DDW组和NaF组分别作为阴性和阳性对照组。

各组试件分别于37 ℃的恒温水浴箱中进行pH循环：2 mL4%PMNE、8%PMNE、12%PMNE溶液、DDW或0.1%NaF等实验溶液浸泡10min，2 mL酸性缓冲液1 h，2 mL中性缓冲液缓冲5 min。每次浸泡后用DDW彻底冲洗1 min，滤纸吸去多余水分，其余时间各试件放入37 ℃中性缓冲液中，每天缓冲3次，共8d。各实验液及中性缓冲液每日更换1次。

1.4  牙本质矿物密度（dentin mineraldensity，DMD）的测定

循环结束后DDW彻底冲洗，室温下用3%戊二醛溶液与0.1 mol·L-1 PBS缓冲液（1︰1，pH=7.2）固定4 h，去除牙本质表面涂布的指甲油，DDW彻底冲洗。将试件置于Micro-CT中在80 kV、80 μA、14 μm层厚条件下进行扫描，三维重建。测定每个标本未脱矿侧约0.996 0 mm×0.996 0 mm大小面积（图1A中黄色区域），且自牙本质表面向内深0.220 4 mm的长方体形区域内（即0.996 0 mm×0.996 0 mm×0.220 4 mm选区，图1B中黄色所示区域）的DMD，作为该样本未脱矿牙本质的矿物密度（normal dentin mineral density，NDMD），每个标本测定4个区域，计算平均值。具体测定方法见图1。

按照未脱矿侧DMD同样测定的方法，将未脱矿侧分析选区框水平平移至同一牙本质块脱矿侧的对称位置，测定同样大小选区内的DMD，即作为pH循环后脱矿牙本质的矿物密度（demineralized dentin mineral density，DDMD），每个标本测定4个区域，求平均值。按照如下公式计算牙本质块NDMD与DDMD的差值（ΔDMD），ΔDMD=NDMD-DDMD。

1.5  表面微观形貌观察

试件经Micro-CT扫描完成后即刻用DDW冲洗，自然干燥，喷金，FE-SEM电镜观察各组脱矿侧牙本质表面微观形貌。

1.6  PMNE中钙、钼和氟含量测定

取4%PMNE溶液稀释100倍，采用电感耦合等离子体质谱仪，测PMNE中钙、钼和氟元素的含量，共测定5个样。每个样品测定3次，求平均值。

1.7  统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件对NDMD、DDMD及ΔDMD进行单因素方差分析，采用组间LSD两两比较，检验水准为0.05。

2  结果

2.1  DMD测量结果

各组NDMD、DDMD和ΔDMD测量结果见表1。由表1可见，各组NDMD间差异无统计学意义（P>0.05）。DDW组DDMD最低，NaF组DDMD最高，两组间DDMD差异有统计学意义（P<0.05）；4%PMNE组DDMD明显高于DDW组，显著低于8%、12%PMNE组和NaF组（P<0.05）；8%pmne组和12%pmne组比较差异无统计学意义（p>0.05），均略低于NaF组，但差异无统计学意义（P>0.05）。DDW组ΔDMD最高，NaF组△DMD最低，两组间差异有统计学意义（P<0.05）；PMNE各组ΔDMD显著高于NaF组，显著低于DDW（P<0.05）；8%pmne组δdmd略低于12%pmne组，但两组间差异无统计学意义（p>0.05），两者均显著低于4%PMNE组（P<0.05）。

2.2  表面微观形貌观察结果

各组pH循环后脱矿牙本质表面微观形貌见图2。由图2可见，DDW组牙本质表面牙本质小管完全暴露，小管开口呈圆形或类圆形，牙本质表面欠平整，未见明显胶原纤维，牙本质小管壁较疏松，可见胶原纤维。NaF组牙本质表面的玷污层完整，未见牙本质小管暴露，表面仅见3~5 μm长度的狭小微裂隙。低倍镜下各浓度PMNE组牙本质表面的玷污层完整性受到不同程度破坏，牙本质小管口部分堵塞，呈不同程度的点隙状开口；4%PMNE组牙本质表面点隙最大，分布最密集。高倍镜下见4%PMNE组牙本质表面牙本质小管口暴露不全，裂隙呈3~5 μm

线状和多角形不规则开口，但牙本质小管开口程度较DDW组明显减小；8%和12%PMNE组牙本质表面的部分牙本质小管被堵塞，部分牙本质小管口不全暴露，呈3~5 μm长的梭形/小的不规则形开口，两组牙本质表面的点隙状开口基本相当，点隙大小和密集程度明显小于4%PMNE组。

2.3  PMNE中钙、钼和氟含量

本样品中钙元素含量为（12.46±0.23） μg·mg-1，钼元素含量为（3.31±0.12） μg·mg-1。本样品不含氟元素。

3  讨论

口腔中的致病菌可利用食物产酸致使釉质、牙本质等牙体硬组织发生脱矿，继而脱矿裸露的胶原纤维等有机基质在酶和唾液环境中降解，导致龋病发生发展[4-5]。本实验在pH循环模式下，以NaF作为对照观察富含黄酮类化合物的PMNE抑制根面牙本质脱矿的作用，并分析PMNE浓度效应，为预防根面龋的发生及抑制其进展提供实验依据。此外，为避免缓冲液对实验结果的干扰，本实验pH循环所用的酸性和中性缓冲液均不含钙离子。

Micro-CT是采用X线成像原理进行超高分辨率三维成像的设备，可在不破坏样本的情况下，定量计算样品内部任意选定区域的体积、面积、孔隙率、矿物密度等[13]。矿物密度是根据体模和标准CT值计算得到并以单位体积的羟磷灰石含量来表示的矿物质含量，可反映单位组织内矿物质的含量[14]。牙本质等牙体组织是以无机物为主的硬组织，具有X线阻射，因而Micro-CT也被用于测定牙体组织的矿物含量和龋病动态过程及疗效观察[15]。本研究采用Micro-CT定量对比分析各组根面牙本质脱矿区、正常未脱矿等大选区内矿物密度值和两者矿物密度差，以评价PMNE抑制酸所致牙本质脱矿的效果。结果表明，NaF和PMNE均可有效抑制根面牙本质脱矿的进展。

由于能够促进牙体组织矿化和减弱酸对牙体组织的脱矿，故氟化物干预是当前减轻龋病进展的有效措施。本实验Micro-CT也证实NaF组牙本质脱矿区与未脱矿区的ΔDMD显著低于DDW组，提示0.1%NaF能有效地减弱酸对根面牙本质的脱矿作用。FESEM见NaF组牙本质表面玷污层完整而DDW组玷污层完全破坏，进一步证实了氟化物提高牙本质耐脱矿或抑制脱矿的能力。研究[12]表明，氟化物在牙本质/釉质表面可与钙离子或羟磷灰石结合形成氟化钙或氟磷灰石，增强根面牙本质抗酸蚀脱矿能力，促进再矿化。

本实验也证实PMNE可抑制酸所致牙本质脱矿，其机制推测主要可能与PMNE保存脱矿牙本质有机基质有关。牙本质是含有约30%有机基质的钙化硬组织，已有研究[16]表明保留脱矿牙本质内的有机基质可为再矿化提供支架，并形成一个机械屏障从而阻止酸的扩散和矿物离子释出。PMNE是从马尾松叶中提取的天然物质，其主要分子结构具有多个酚羟基的原花青素、黄酮类等生物活性成分[8-9]。原花青素、五倍子等含多酚结构的物质可通过共价键、离子键、氢键等与蛋白质反应，增加交联度，增强胶原基质，使非胶原蛋白凝固，抑制金属基质蛋白酶活性，减轻脱矿牙本质的降解[8,11-12,16]。据此推测，PMNE抑制根面牙本质脱矿的可能机制是PMNE通过原花青素、黄酮类等有效成分的多酚结构与胶原基质的相互作用，增强了胶原基质的交联，抑制其降解，从而保存了脱矿牙本质有机基质并形成屏障。该屏障可一定程度阻碍pH循环过程中的H+扩散从而减轻脱矿。另外，由于原花青素的交联作用以及其B环上酚羟基的螯合作用[8,12]，交联于脱矿牙本质胶原基质的原花青素还可以通过B环上酚羟基螯合因脱矿释出的部分钙离子，从而阻碍钙离子释出。因而，虽经pH循环，PMNE组牙本质玷污层未完全被酸去除，表现为牙本质小管仍部分堵塞，而阴性对照DDW组玷污层完全被去掉，牙本质小管完全暴露，且PMNE组ΔDMD显著低于DDW组。

此外，PMNE抑制根面组织脱矿的作用可能还与PMNE中含有的钙元素和钼元素相关。松针提取物中还含有钙、磷、钼等多种元素。本研究采用质谱仪也证实本实验所用PMNE中含有（3.31±0.12）μg·mg-1钼元素，（12.46±0.23） μg·mg-1钙元素。据此推测，一方面PMNE溶液中所含钙可沉积在脱矿牙本质表面，能促进表面的残余羟磷灰晶体生长；另一方面PMNE处理后，其内钼元素沉积于脱矿牙体表面，还可能增加牙本质抵抗pH循环中酸的侵蚀。据报道，增加摄入钼元素可增强牙齿的硬度和牢固度，预防龋齿，还可提高氟再矿化表层下釉质的功效。然而钼元素是如何发挥作用的机制还有待进一步研究。

本实验中8%PMNE组和12%PMNE组抑制牙本质脱矿效果优于4%PMNE。结果提示，8%PMNE即可达到良好的抑制牙本质脱矿的效果。结果可能与单位体积高浓度PMNE溶液中多酚含量、钼元素等有效成分相对较多有关，到8%浓度时PMNE即含有能与脱矿牙本质反应的最适量有效成分。然而，PMNE是混合物，其有效成分除原花青素和钼元素外，是否还有其他抑制牙本质脱矿的成分还有待进一步研究。

来源于华西口腔医学杂志